微生物技术国家重点实验室符军教授团队联合湖南师范大学尹佳副教授团队利用噬菌体编码的同源重组系统和CRISPR-Cas3系统对假单胞菌进行精准基因组工程编辑，开发了非模式假单胞菌的高效基因组编辑技术，在Nature Protocols上在线发表了题为“Precise genome engineering inPseudomonas using phage-encoded homologous recombination and the Cascade-Cas3 system”的论文。山东大学微生物技术国家重点实验室教授符军、长聘副研究员李瑞娟，湖南师范大学副教授尹佳为共同通讯作者，山东大学郑文韬、湖南师范大学夏艳东为论文的共同第一作者。山东大学微生物技术国家重点实验室为第一完成单位和通讯作者单位。
基于噬菌体编码的同源重组系统是细菌基因组编辑的有效工具。应用最普遍的是在大肠杆菌λ噬菌体中发现的Red系统以及在Rac原噬菌体中发现的RecET系统，基于噬菌体同源重组酶Redα/Redβ和RecE/RecT建立的同源重组系统统称为DNA同源重组工程（Recombineering），也称Red/ET同源重组工程。DNA同源重组工程经过20多年的发展，已经在生物领域获得了非常广泛的应用。然而，噬菌体同源重组酶具有一定的宿主特异性。山东大学微生物技术国家重点实验室符军教授团队基于噬菌体编码的重组酶系统开发了一系列细菌的同源重组系统，包括发光杆菌、致病杆菌、假单胞菌、伯克氏菌、农杆菌、枯草芽孢杆菌等。
假单胞菌是一种革兰氏阴性、杆状、需氧细菌，约有200种，易培养性、多样性和丰富的代谢功能使其成为科学研究的优秀对象。作为一个被高度研究的细菌属，可获得基因组信息的物种数量在不断增加（目前假单胞菌基因组数据库中有4,847个基因组序列）。然而，假单胞菌中只有少数蛋白质编码区被证实具有生物学作用，基因组资源挖掘效率较低，需要通用和高效的遗传操作工具来精确编辑假单胞菌基因组。
前期，符军教授团队开发了假单胞菌特异性噬菌体编码的同源重组系统，在iScience上发表了题为“Single-stranded DNA-binding protein and exogenous RecBCD inhibitors enhance phage-derived homologous recombination inPseudomonas”的研究论文。利用假单胞菌DNA同源重组系统对假单胞菌进行基因组挖掘可以获得新型活性天然产物，相关工作以“Recombineering facilitates the discovery of natural product biosynthetic pathways inPseudomonas parafulva”为题发表在Biotechnology Journal。将来自铜绿假单胞菌的I–C型CRISPR-Cas3系统PaeCas3c与假单胞菌同源重组系统相结合，显著提高了假单胞菌同源重组系统重组的正确率，极大地降低了假阳性，在Engineering Microbiology上发表了题为“Cascade-Cas3 facilitates high-accuracy genome engineering inPseudomonas using phage-encoded homologous recombination”的论文。
本文主要介绍符军教授团队和湖南师范大学尹佳副教授团队基于噬菌体编码同源重组系统和CRISPR-Cas3系统开发了假单胞菌的精确基因组工程。
假单胞菌新菌株重组系统优化及基因组编辑
a.对假单胞菌进行抗性筛选、生长曲线评估和转化优化，包括电穿孔关键时间点的确定；b.筛选最佳重组体系
研究人员针对假单胞菌缺乏通用和有效的遗传操作方法这一关键问题开展工作。以噬菌体编码的同源重组工具（PEHR）为改造基础，该PEHR系统基于来自铜绿假单胞菌噬菌体Ab31中与λRed同源的操纵子（BAS）和来自丁香假单胞菌Rac噬菌体中与RecET同源的操纵子（Rec-TEPsy）。同时添加外源元件，包括RecBCD抑制剂（Redγ或Pluγ）和单链DNA结合蛋白（SSB），以提高PEHR重组效率。为了解决假单胞菌使用PEHR系统编辑时的假阳性问题，将I-C型的CRISPR-Cas3系统与PEHR结合，显著提高了基因编辑的正确率。本研究详细介绍了假单胞菌基于噬菌体编码同源重组系统（Phage-encoded homologous recombination, PEHR）和CRISPR-Cas3系统（又被称为compact Cascade-Cas3 system）PaeCas3c系统的PEHR-Cas3的构建方法。主要是使用标准化盒式元件，协同使用SacB反选择和Cre位点特异性重组酶进行无标记或无痕基因组修饰，并与具有选择性复制模板R6K的载体相结合，以最大限度地减少重组背景。与传统的等位基因交换编辑方法相比，PEHR-Cas3系统不需要构建携带长同源臂的自杀质粒，从而简化了实验程序，缩短了无痕编辑周期。与单独基于噬菌体重组酶的基因组编辑系统相比，PEHR-Cas3系统可以利用Cas3蛋白的切割能力有效提高突变体的筛选效率。该研究建立了假单胞菌物种完整的遗传操作的方法，总结了重组工程的流程和关键工具，用于非模式假单胞菌的基因敲除、插入和单碱基突变，有效扩充了基因编辑工具库，加快了细菌基因组资源的研究进程。
【来源：山大视点 编辑：杨欣悦 审核：王琼】
